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细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒的使用方法
点击次数:2354 发布时间:2013-01-23
  使用说明:
  
  1.准备溶液:温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽
  
  提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的zui终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试
  
  剂备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的zui终浓度为1mM。
  
  2.对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,
  
  并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,尽zui大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶
  
  消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
  
  3.对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽zui大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
  
  4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞,其细胞
  
  沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)
  
  5.zui高速剧烈Vortex5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可
  
  以适当延长vortex时间。)
  
  6.冰浴10-15分钟。
  
  7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。zui高速剧烈Vortex5秒,冰浴1分钟。
  
  8.zui高速剧烈Vortex5秒,4℃12,000-16,000g离心5分钟。
  
  9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千
  
  万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)
  
  10.对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会
  
  带来细胞浆蛋白的污染。)
  
  11.zui高速剧烈Vortex15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速
  
  剧烈Vortex15-30秒,共30分钟。
  
  12.4℃12,000-16,000g离心10分钟。
  
  13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻
  
  存。
  
  14.对于新鲜组织:
  
  A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例
  
  如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至zui终浓度为1mM配制成
  
  组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液,并在玻璃
  
  匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
  
  B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置15分钟。
  
  C.4℃1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上
  
  清时千万不要触及沉淀。)
  
  D.对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开
  
  始操作,即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作,按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋
  
  白和细胞核蛋白。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14C中抽提得到的细胞浆蛋白合并。 上一篇 唾液酸受体有助阻断流感病毒传染 下一篇 超滤的应用



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